近日，廈門大學附屬第一醫(yī)院神經外科及福建省神經系統(tǒng)腫瘤診斷與精準治療王占祥教授團隊在國際知名學術期刊《Cell Death & Disease》（中科院一區(qū)TOP期刊，影響因子9.685）上發(fā)表了題為“The CDK inhibitor AT7519 inhibits human glioblastoma cell growth by inducing apoptosis, pyroptosis and cell cycle arrest”的原創(chuàng)性基礎研究論文。廈門大學醫(yī)學院在讀碩士趙文鵬為該論文的第一作者，廈門大學附屬第一醫(yī)院神經外科王占祥教授和張炳長助理研究員為該論文的共同通訊作者。

膠質母細胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤之一。膠質母細胞瘤患者的一線治療方案是以手術切除為主的綜合治療，包括術后放療聯(lián)合替莫唑胺（TMZ）輔助化療。然而，目前GBM患者的預后不佳，中位生存期仍不到15個月。尋找治療GBM的新藥迫在眉睫。

本論文采用高通量藥物篩選的方法，在臨床期小分子藥物庫中發(fā)現(xiàn)CDK抑制劑AT7519對GBM具有潛在的抗腫瘤活性。AT7519是第二代多靶點周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可選擇性抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK6和CDK9。AT7519不但影響細胞周期的進程，而且抑制RNA聚合酶II下游的轉錄。AT7519在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的安全性和強大的抗腫瘤活性，目前處于臨床開發(fā)階段。但是AT7519在膠質母細胞瘤中的抗腫瘤機制目前還不清楚。

用去除血清饑餓的方法將細胞周期同步化之后，U251和U87MG細胞單獨用培養(yǎng)基和0.4 mM的AT7519培養(yǎng)6、12和24 h，PI染色后流式儀分析細胞周期的具體比例，結果顯示AT7519 處理U251和U87MG細胞6h后，G1期和G2期細胞比例開始增加。當AT7519 處理U251和U87MG細胞24h時，G1期細胞的比例顯著增加。Western blot結果顯示與細胞周期G1-S轉化有關的p-RB,p-CDK2表達量顯著下降, 與細胞周期G2-M轉化有關的p-CDK1,cyclin B1表達量顯著下降。綜上所述，AT7519將U87MG和U251細胞阻滯在G1和G2期。

U87MG, U251和GBM 原代細胞在AT7519處理后進行PI 和 Annexin-V -FITC 染色，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。結果顯示在U87MG和U251細胞中，AT7519以濃度依賴的方式顯著增加凋亡細胞的比例。在GBM60 細胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細胞比例是12.03% VS 77.93% (p < 0.0001，非配對t檢驗)，在GBM38 細胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細胞比例是8.39% VS 69.73% (p < 0.0001，非配對t檢驗)。Western blot結果顯示隨著AT7519濃度的升高，抗凋亡蛋白MCL-1和BCL-2表達量在U87MG和U251 細胞中顯著下降，促凋亡蛋白NOXA和線粒體釋放Cyt-c表達量顯著升高。這些內源性凋亡信號分子的變化激活下游caspase-9, caspase-3 , and PARP1的活性, 出現(xiàn)cleaved caspase-9，cleaved caspase-3，cleaved PARP1這三種凋亡關鍵蛋白的表達增加。JC-1染色結果顯示，AT7519可顯著降低U251和U87MG細胞的線粒體膜電位(p < 0.05，非配對t檢驗)。我們進一步在GBM原代細胞中檢測凋亡關鍵蛋白表達情況。Western blot結果顯示凋亡的標志性蛋白cleaved PARP1、cleaved caspase-3在AT7519處理組中顯著增加。以上結果證明AT7519可以誘導GBM細胞凋亡。

倒置顯微鏡下觀察AT7519處理48 h后的細胞形態(tài)，與對照組相比，在AT7519處理組中觀察到U251和U87MG細胞上有氣泡樣的突起。掃描電鏡顯示AT7519處理后的U251和U87MG細胞膜上有多個小孔。此外，在LDH釋放實驗中，AT7519處理后的U87MG和U251細胞LDH釋放增多(p < 0.0001，非配對t檢驗)，提示細胞膜的完整性受到了破壞。Western blot檢測了gasdermin家族蛋白及其裂解蛋白，結果顯示在U87MG和U251細胞中，隨著AT7519濃度的提高GSDME-N表達量逐漸升高。進一步我們在GBM原代細胞進行了驗證，Western blot結果顯示AT7519處理后焦亡的打孔蛋白GSDME-N表達增加。以上結果證明，AT7519誘導gasdermin E裂解產生打孔蛋白，進一步出現(xiàn)細胞腫脹、破裂，導致GBM細胞焦亡。接下來先用Z-VAD-FMK預處理，然后用AT7519處理GBM細胞48 h。Western blot結果表明與單獨使用AT7519對比，Z-VAD-FMK和AT7519聯(lián)合組中cleaved PARP1 and GSDME-N蛋白表達量顯著下降。LDH釋放實驗結果顯示，與單獨使用AT7519對比，Z-VAD-FMK與AT7519聯(lián)合處理后U87MG和U251細胞LDH釋放量顯著減少。進一步Western blot結果顯示，caspase‐3特異性抑制劑（Z‐DEVD‐FMK）可以抑制GSDME-N的表達。以上結果證明AT7519通過caspase-3裂解gasdermin E誘導GBM細胞焦亡。

為了探究AT7519在體內是否有抗腫瘤的作用。我們用U87MG細胞建立GBM皮下異種移植模型，5天后以20mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射21天。期間定期測量裸鼠的體重和腫瘤的體積。7天后，AT7519治療組的皮下腫瘤體積開始減小；到21天時AT7519治療組的皮下腫瘤重量和體積均明顯減小，并且小鼠體重沒有明顯的變化。在初步探究AT7519在體內的安全性和抗腫瘤作用后，我們又在GBM顱內異種移植裸鼠中驗證AT7519的抗腫瘤活性。同樣以20mg/kg的AT7519連續(xù)腹腔注射AT7519 21天，腦組織冠狀位切片后HE染色的結果顯示AT7519治療后顱內腫瘤相對面積減少約一半(p < 0.05，非配對t檢驗)。Western blot檢測細胞焦亡、凋亡和細胞周期相關關鍵蛋白，結果顯示AT7519處理組中cleaved caspase-3, cleaved PARP1和GSDME-N水平升高，而p-CDK1和p-CDK2蛋白水平降低。免疫組化的結果顯示，與對照組相比，AT7519治療組腫瘤中的cleaved caspase-3和cleaved PARP1表達增加，p-CDK1和p-CDK2表達明顯減少。以上結果證明AT7519在體內通過誘導凋亡、焦亡和細胞周期阻滯抑制膠質母細胞瘤生長。

綜上所述，AT7519在GBM細胞系、原代細胞和異種移植裸鼠中通過阻滯細胞周期進程、誘導細胞凋亡和焦亡的方式顯著抑制腫瘤的生長。因此，AT7519是一種治療GBM的潛在小分子靶向藥物。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-022-05528-8

通訊作者

王占祥，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，中國醫(yī)療行業(yè)最高獎“中國醫(yī)師獎”獲得者，國務院特殊津貼專家。

從事臨床醫(yī)學研究與疾病救治工作近40年，曾留學日本，多次到美國哈佛大學，英國牛津大學等國際知名學術機構進行交流訪問，先后獲得福建省優(yōu)秀歸國人員，福建省突出貢獻中青年專家，入選福建省新世紀百千萬人才工程。他是廈門市重點引進留學歸國人才，廈門市杰出科技人才，廈門市領軍人才，首屆廈門市醫(yī)學學術與技術帶頭人，廈門市腦科中心學科帶頭人，2022年被評為廈門經濟特區(qū)建設40周年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人物，廈門市科學技術重大貢獻獎獲得者。

現(xiàn)任廈門大學附屬第一醫(yī)院院長，新冠肺炎定點救治醫(yī)院院長，國家神經系統(tǒng)疾病醫(yī)學中心福建分中心主任，福建省腦科疾病臨床醫(yī)學研究中心主任，福建省神經系統(tǒng)腫瘤診斷與精準治療重點實驗室主任，廈門大學神經科學系主任。

王占祥是我國知名的神經外科專家和學科帶頭人，先后主持國家自然科學基金、國際交流課題、新冠應急攻關項目，以及福建省和廈門市醫(yī)療衛(wèi)生重點項目等20余個項目。在 STTT， JCI， Nat Commun 等Top期刊發(fā)表論文 280 余篇（SCI 收錄 80 篇），參編參譯專著 12 部，參與臨床救治指南和專家共識12項，獲批實用新型專利 8 項，獲軍隊、省、市級科技獎勵11項。指導了福建省神經外科專業(yè)第一位博士后，目前已指導博士后 7 位，培養(yǎng)博、碩士研究生 63 人。

第一作者

張炳長，博士，神經外科助理研究員。作為項目負責人主持福建省自然科學基金項目1項，參與4項科學基金，包括自然科學基金項目1項，省市新冠應急攻關項目各1項。在《Signal Transduct Target Ther》、《Sci China Life Sci》、《Cell Death and Disease》多個雜志發(fā)表SCI論文十余篇。

第一作者

趙文鵬，2020級廈門大學醫(yī)學院專業(yè)型外科學碩士研究生，師從全國知名神經外科專家王占祥教授，碩士期間主要從事膠質瘤新藥的高通量篩選及抗腫瘤機制研究。目前發(fā)表SCI論文9篇（其中第一作者2篇），相關研究成果受邀在中華醫(yī)學會神經外科分會第十九次全國年會大會匯報。2023年榮獲廈門大學“柳玉濱青年科技獎學金”。