近日，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科及福建省神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷與精準(zhǔn)治療王占祥教授團(tuán)隊在國際知名學(xué)術(shù)期刊《Cell Death & Disease》（中科院一區(qū)TOP期刊，影響因子9.685）上發(fā)表了題為“The CDK inhibitor AT7519 inhibits human glioblastoma cell growth by inducing apoptosis, pyroptosis and cell cycle arrest”的原創(chuàng)性基礎(chǔ)研究論文。廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀碩士趙文鵬為該論文的第一作者，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科王占祥教授和張炳長助理研究員為該論文的共同通訊作者。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的一線治療方案是以手術(shù)切除為主的綜合治療，包括術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺（TMZ）輔助化療。然而，目前GBM患者的預(yù)后不佳，中位生存期仍不到15個月。尋找治療GBM的新藥迫在眉睫。

本論文采用高通量藥物篩選的方法，在臨床期小分子藥物庫中發(fā)現(xiàn)CDK抑制劑AT7519對GBM具有潛在的抗腫瘤活性。AT7519是第二代多靶點周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可選擇性抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK6和CDK9。AT7519不但影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，而且抑制RNA聚合酶II下游的轉(zhuǎn)錄。AT7519在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的安全性和強大的抗腫瘤活性，目前處于臨床開發(fā)階段。但是AT7519在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的抗腫瘤機(jī)制目前還不清楚。

用去除血清饑餓的方法將細(xì)胞周期同步化之后，U251和U87MG細(xì)胞單獨用培養(yǎng)基和0.4 mM的AT7519培養(yǎng)6、12和24 h，PI染色后流式儀分析細(xì)胞周期的具體比例，結(jié)果顯示AT7519 處理U251和U87MG細(xì)胞6h后，G1期和G2期細(xì)胞比例開始增加。當(dāng)AT7519 處理U251和U87MG細(xì)胞24h時，G1期細(xì)胞的比例顯著增加。Western blot結(jié)果顯示與細(xì)胞周期G1-S轉(zhuǎn)化有關(guān)的p-RB,p-CDK2表達(dá)量顯著下降, 與細(xì)胞周期G2-M轉(zhuǎn)化有關(guān)的p-CDK1,cyclin B1表達(dá)量顯著下降。綜上所述，AT7519將U87MG和U251細(xì)胞阻滯在G1和G2期。

U87MG, U251和GBM 原代細(xì)胞在AT7519處理后進(jìn)行PI 和 Annexin-V -FITC 染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示在U87MG和U251細(xì)胞中，AT7519以濃度依賴的方式顯著增加凋亡細(xì)胞的比例。在GBM60 細(xì)胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細(xì)胞比例是12.03% VS 77.93% (p < 0.0001，非配對t檢驗)，在GBM38 細(xì)胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細(xì)胞比例是8.39% VS 69.73% (p < 0.0001，非配對t檢驗)。Western blot結(jié)果顯示隨著AT7519濃度的升高，抗凋亡蛋白MCL-1和BCL-2表達(dá)量在U87MG和U251 細(xì)胞中顯著下降，促凋亡蛋白NOXA和線粒體釋放Cyt-c表達(dá)量顯著升高。這些內(nèi)源性凋亡信號分子的變化激活下游caspase-9, caspase-3 , and PARP1的活性, 出現(xiàn)cleaved caspase-9，cleaved caspase-3，cleaved PARP1這三種凋亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)增加。JC-1染色結(jié)果顯示，AT7519可顯著降低U251和U87MG細(xì)胞的線粒體膜電位(p < 0.05，非配對t檢驗)。我們進(jìn)一步在GBM原代細(xì)胞中檢測凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示凋亡的標(biāo)志性蛋白cleaved PARP1、cleaved caspase-3在AT7519處理組中顯著增加。以上結(jié)果證明AT7519可以誘導(dǎo)GBM細(xì)胞凋亡。

倒置顯微鏡下觀察AT7519處理48 h后的細(xì)胞形態(tài)，與對照組相比，在AT7519處理組中觀察到U251和U87MG細(xì)胞上有氣泡樣的突起。掃描電鏡顯示AT7519處理后的U251和U87MG細(xì)胞膜上有多個小孔。此外，在LDH釋放實驗中，AT7519處理后的U87MG和U251細(xì)胞LDH釋放增多(p < 0.0001，非配對t檢驗)，提示細(xì)胞膜的完整性受到了破壞。Western blot檢測了gasdermin家族蛋白及其裂解蛋白，結(jié)果顯示在U87MG和U251細(xì)胞中，隨著AT7519濃度的提高GSDME-N表達(dá)量逐漸升高。進(jìn)一步我們在GBM原代細(xì)胞進(jìn)行了驗證，Western blot結(jié)果顯示AT7519處理后焦亡的打孔蛋白GSDME-N表達(dá)增加。以上結(jié)果證明，AT7519誘導(dǎo)gasdermin E裂解產(chǎn)生打孔蛋白，進(jìn)一步出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、破裂，導(dǎo)致GBM細(xì)胞焦亡。接下來先用Z-VAD-FMK預(yù)處理，然后用AT7519處理GBM細(xì)胞48 h。Western blot結(jié)果表明與單獨使用AT7519對比，Z-VAD-FMK和AT7519聯(lián)合組中cleaved PARP1 and GSDME-N蛋白表達(dá)量顯著下降。LDH釋放實驗結(jié)果顯示，與單獨使用AT7519對比，Z-VAD-FMK與AT7519聯(lián)合處理后U87MG和U251細(xì)胞LDH釋放量顯著減少。進(jìn)一步Western blot結(jié)果顯示，caspase‐3特異性抑制劑（Z‐DEVD‐FMK）可以抑制GSDME-N的表達(dá)。以上結(jié)果證明AT7519通過caspase-3裂解gasdermin E誘導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡。

為了探究AT7519在體內(nèi)是否有抗腫瘤的作用。我們用U87MG細(xì)胞建立GBM皮下異種移植模型，5天后以20mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射21天。期間定期測量裸鼠的體重和腫瘤的體積。7天后，AT7519治療組的皮下腫瘤體積開始減小；到21天時AT7519治療組的皮下腫瘤重量和體積均明顯減小，并且小鼠體重沒有明顯的變化。在初步探究AT7519在體內(nèi)的安全性和抗腫瘤作用后，我們又在GBM顱內(nèi)異種移植裸鼠中驗證AT7519的抗腫瘤活性。同樣以20mg/kg的AT7519連續(xù)腹腔注射AT7519 21天，腦組織冠狀位切片后HE染色的結(jié)果顯示AT7519治療后顱內(nèi)腫瘤相對面積減少約一半(p < 0.05，非配對t檢驗)。Western blot檢測細(xì)胞焦亡、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)關(guān)鍵蛋白，結(jié)果顯示AT7519處理組中cleaved caspase-3, cleaved PARP1和GSDME-N水平升高，而p-CDK1和p-CDK2蛋白水平降低。免疫組化的結(jié)果顯示，與對照組相比，AT7519治療組腫瘤中的cleaved caspase-3和cleaved PARP1表達(dá)增加，p-CDK1和p-CDK2表達(dá)明顯減少。以上結(jié)果證明AT7519在體內(nèi)通過誘導(dǎo)凋亡、焦亡和細(xì)胞周期阻滯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長。

綜上所述，AT7519在GBM細(xì)胞系、原代細(xì)胞和異種移植裸鼠中通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和焦亡的方式顯著抑制腫瘤的生長。因此，AT7519是一種治療GBM的潛在小分子靶向藥物。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-022-05528-8

通訊作者

王占祥，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，中國醫(yī)療行業(yè)最高獎“中國醫(yī)師獎”獲得者，國務(wù)院特殊津貼專家。

從事臨床醫(yī)學(xué)研究與疾病救治工作近40年，曾留學(xué)日本，多次到美國哈佛大學(xué)，英國牛津大學(xué)等國際知名學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)進(jìn)行交流訪問，先后獲得福建省優(yōu)秀歸國人員，福建省突出貢獻(xiàn)中青年專家，入選福建省新世紀(jì)百千萬人才工程。他是廈門市重點引進(jìn)留學(xué)歸國人才，廈門市杰出科技人才，廈門市領(lǐng)軍人才，首屆廈門市醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人，廈門市腦科中心學(xué)科帶頭人，2022年被評為廈門經(jīng)濟(jì)特區(qū)建設(shè)40周年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人物，廈門市科學(xué)技術(shù)重大貢獻(xiàn)獎獲得者。

現(xiàn)任廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院院長，新冠肺炎定點救治醫(yī)院院長，國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病醫(yī)學(xué)中心福建分中心主任，福建省腦科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心主任，福建省神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷與精準(zhǔn)治療重點實驗室主任，廈門大學(xué)神經(jīng)科學(xué)系主任。

王占祥是我國知名的神經(jīng)外科專家和學(xué)科帶頭人，先后主持國家自然科學(xué)基金、國際交流課題、新冠應(yīng)急攻關(guān)項目，以及福建省和廈門市醫(yī)療衛(wèi)生重點項目等20余個項目。在 STTT， JCI， Nat Commun 等Top期刊發(fā)表論文 280 余篇（SCI 收錄 80 篇），參編參譯專著 12 部，參與臨床救治指南和專家共識12項，獲批實用新型專利 8 項，獲軍隊、省、市級科技獎勵11項。指導(dǎo)了福建省神經(jīng)外科專業(yè)第一位博士后，目前已指導(dǎo)博士后 7 位，培養(yǎng)博、碩士研究生 63 人。

第一作者

張炳長，博士，神經(jīng)外科助理研究員。作為項目負(fù)責(zé)人主持福建省自然科學(xué)基金項目1項，參與4項科學(xué)基金，包括自然科學(xué)基金項目1項，省市新冠應(yīng)急攻關(guān)項目各1項。在《Signal Transduct Target Ther》、《Sci China Life Sci》、《Cell Death and Disease》多個雜志發(fā)表SCI論文十余篇。

第一作者

趙文鵬，2020級廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院專業(yè)型外科學(xué)碩士研究生，師從全國知名神經(jīng)外科專家王占祥教授，碩士期間主要從事膠質(zhì)瘤新藥的高通量篩選及抗腫瘤機(jī)制研究。目前發(fā)表SCI論文9篇（其中第一作者2篇），相關(guān)研究成果受邀在中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科分會第十九次全國年會大會匯報。2023年榮獲廈門大學(xué)“柳玉濱青年科技獎學(xué)金”。